Высокомолекулярная ДНК и секвенирование длинных фрагментов
16.02.2022
Представьте, что вы собираете большую и сложную мозаику, состоящую из тысяч очень маленьких кусочков. Вы выкладываете их все и пытаетесь разобраться в них. Было бы намного проще собрать эту головоломку, если бы кусочки были крупнее и содержали большие фрагменты красивого изображения на коробке. То же самое можно сказать и о секвенировании генома.
Традиционное секвенирование с коротким считыванием или NGS основано на сплайсинге ДНК на небольшие фрагменты (≤300 пар оснований) и последующей амплификации. Хотя этот тип секвенирования полезен для обнаружения небольших генетических вариантов, таких как однонуклеотидные изменения в ДНК, он может не выявить более крупные вариации (обычно более 50 пар оснований) в геноме. Секвенирование с длинным чтением (Long-Read Sequencing, LRS) или секвенирование третьего поколения позволяет более точно собирать геномы, способствуя лучшему обнаружению структурных вариантов, таких как вариации числа копий, дупликации, транслокации и инверсии, которые слишком велики для идентификации с помощью секвенирования с коротким чтением. Секвенирование с длинными ридами позволяет заполнить незавершенные «темные области» генома и может использоваться для сборки более крупных и сложных геномов с использованием более длинных фрагментов ДНК или ДНК с высокой молекулярной массой (HMW).
ДНК HMW может иметь длину от 20 до 100 тысяч оснований (кб) и подходит для приложений, включая LRS, секвенирование De Novo (или построение генома с нуля) и оптическое картирование. ДНК HMW может предложить более полное представление о геноме, которое невозможно получить методами NGS. Извлечение и выделение HMW ДНК достаточного размера, количества и качества может быть утомительным и длительным процессом. Обычный метод очистки ДНК HMW включает очистку ДНК от агарозных пробок. Этот метод является сложным и дорогостоящим, требующим много практического времени. Более простым и экономичным вариантом очистки высококачественной ДНК HMW является набор Wizard® HMW DNA Extraction Kit от Promega.
Набор Wizard® HMW DNA Extraction Kit предназначен для выделения ДНК длиной до 500 т.п.н. с высокой степенью чистоты, подходящей для LRS на таких платформах, как предлагаемые Oxford Nanopore и PacBio. Набор Wizard® можно использовать с различными типами образцов, включая кровь, ткани растений, бактерии, клетки и ткани млекопитающих. Весь рабочий процесс с набором Wizard® HMW DNA Extraction Kit может быть завершен примерно за 1,5 часа без использования опасных химикатов или специального оборудования. Имеются примечания по применению для различных типов образцов с протоколами и советами по повышению производительности.
ДНК с высокой молекулярной массой с длиной выше 50 т.п.н. чрезвычайно чувствительна и может быть особенно подвержена расщеплению. Важно осторожно обращаться с ДНК HMW во время подготовки и очистки. Promega предлагает советы и рекомендации по сохранению целостности ДНК HMW во время процесса очистки, чтобы обеспечить высокое качество результатов. Посмотрите видеоролики о правильных методах выделения и очистки ДНК HMW в оригинальной статье по ссылке ниже .
автор